doi: 10.3969issn。0253-2417.2014.05.014 棓单宁降解菌种筛选及发酵条件优化，王成章 1、2 中国林业科学研究院林产化工研究所；生物质化工利用国家工程实验室；国家林业局林产化工重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室,江苏南京 210042; 中国林业科学研究院林业新技术研究所, 北京 1000913; 湖北省林业科学研究院, 武汉 43007, 湖北9)闵凡琴通过平板包衣、划线分离、菌落观察等方法，从姜黄的自然生长菌落中分离纯化出单宁降解率65株的11株菌株提炼。进行了响应面法。结果表明，酶生产的最佳条件比培养温度31、初始培养基pH 0、最佳培养时间50 mL高27.7%。关键词：没食子单宁；优良的降解菌株；筛选；发酵条件优化, 叶建忠, 李文军, 卢立化工林产品, CAF;国家工程实验室.生物质化学利用;KeyOpenLab.ForestChemical Engineering,SFA;KeyLab.BiomassEnergyMaterial,江苏省,南京210042;中国科学院林业新技术研究所,北京100091; 湖北省林业科学研究院, 武汉 430079, 中国) 从天然发酵的土耳其胆汁提取物菌落观察等中筛选出 11 株提取单宁酸降解的菌株。发现了一种高单宁酸降解菌株，命名菌株降解率单宁酸达到超过65发酵液，浓度没食子酸鞣酸酶活性mL。发酵条件使用响应面法进行了优化。温度、初始 pH 值、孵育时间结果显示最佳温度、初始 pH 值孵育时间条件、鞣酸酶活性从 mL 增加，并提高了 27.2% 关键词：单宁酸土耳其瘿；优质降解菌株；筛选；优化发酵条件植物受到昆虫和由此产生的异常结构。发酵条件使用响应面法进行了优化。温度、初始 pH 值、孵育时间结果显示最佳温度、初始 pH 值孵育时间条件、鞣酸酶活性从 mL 增加，并提高了 27.2% 关键词：单宁酸土耳其瘿；优质降解菌株；筛选；优化发酵条件植物受到昆虫和由此产生的异常结构。发酵条件使用响应面法进行了优化。温度、初始 pH 值、孵育时间结果显示最佳温度、初始 pH 值孵育时间条件、鞣酸酶活性从 mL 增加，并提高了 27.2% 关键词：单宁酸土耳其瘿；优质降解菌株；筛选；优化发酵条件植物受到昆虫和由此产生的异常结构。
其主要成分是没食子单宁，是没食子酸与不同构型的葡萄糖结合而成的混合物，其结构不同于中国的没食子单宁。没食子酸是没食子单宁的降解产物，也称为双酸、没食子酸。广泛用于有机合成、涂料、医药、食品、化工、制革、日化、矿物等没食子酸酯类化合物、三羟基苯甲酰胺、三甲氧基苯甲醛（TMB）和三甲氧基苄胺嘧啶（TMP）。近年来，收稿日期：2014-01-18 基金项目：国家863计划（2014AA021802国际科技合作专项（2014DFR31300，女，山东临沂人，硕士研究生），研究方向：天然产物研究与开发 通讯作者: 国内外学者对没食子单宁和塔拉单宁降解菌株的筛选及发酵条件的优化进行了研究。已经取得了一些进展[10-16]。没食子单宁酸和塔拉单宁酸相比，没食子单宁具有多倍体基，水解后可生成没食子酸。高优势。
但国内外关于棓单宁降解菌株筛选的报道较少。本研究以没食子单宁为诱导剂，筛选出能高效降解没食子单宁的菌株，并优化发酵条件。火鸡斑马原料和试剂由南京龙源天然多酚合成厂提供，实验室制备没食子单宁：筛25mm得火鸡斑马粉；按料液比称取一定量的火鸡斑马粉（min，10min），分离姜黄水提取物，提取液冷冻干燥，得棓单宁。Folin-Denis试剂，国药化学试剂有限公司；单宁酸标准品和没食子酸标准品购自林产化工研究所；培养基试剂均为国内分析纯。设备仪器 SW-CJ-2双单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LDZX-30KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HWS智能恒温恒湿培养箱，宁波江南仪器厂；ZWY-110X30复式水浴振荡器，上海志诚；722型可见分光光度计，上海晶华科技仪器有限公司平板初筛培养基：蔗糖20g，NaNO溴酚蓝30mL，没食子鞣质g，琼脂20g，加水定容至000mL，自然pH，1 Pa灭菌30分钟。2)平板斜面保鲜培养基：200g马铃薯，切成小块，加000mL水煮沸30min，
没食子单宁降解菌株的分离纯化 能产生单宁酶的菌株在含有溴酚蓝的平板培养基上生长时，会将没食子单宁水解成没食子酸，培养基颜色由蓝紫色变为黄色。可以分离出没食子单宁降解细菌 [17-18]。分离纯化在没食子单宁水提取物中自然生长的菌落。按无菌操作，将mL提取液稀释10倍至10-1、10、10-3，取10mL涂于平板初筛培养基上，培养30·72 , 进行了观察。菌落生长，挑出单个菌落产生透明圆圈或在平板培养基上使培养基变黄，反复划线直至菌落纯。根据颜色的深浅和菌落周围形成的圆圈的直径，可以初步判断菌株的鞣酸酶活性[19]。据此，从分离菌株中筛选出生长速度快、变色圈明显或直径较大的菌株。在无菌超净工作台上，将活化后的菌株接种到装有液体发酵培养基的培养瓶中，用TLC法恒温培养30 min，考察没食子单宁的降解率。每隔10天，测定每株没食子单宁的降解率、培养基中没食子酸的浓度和单宁酶活性。以没食子单宁降解率对初筛菌株进行重新筛选，以没食子酸浓度和单宁酶活性为指标。再筛选采用液体发酵法，筛选出没食子单宁降解能力强、产酶活性高的优良菌株。
86 优良没食子单宁降解菌发酵条件的优化 在单因素实验和文献报道的基础上，选择对培养基中单宁酶活性影响较大的因素为培养温度、初始pH值和培养时间。Behnken 的实验设计和检测方法 薄层色谱法 (TLC) 将发酵液过滤后点样在硅胶上 GF254 TLC 法初步分析没食子鞣质的降解率。显影剂为1，显色剂为碘蒸气。没食子单宁降解率的测定：用Folin-Denis[20]测定没食子单宁的含量，绘制的标准曲线方程为：99931。发酵后没食子单宁降解率中没食子酸浓度中没食子单宁含量及酶活性测定：基于没食子酸、甲醇和罗丹宁在520 nm处形成的发色团物质的特征吸收[二十一]。取少量培养液，滤出菌丝体，吸取250升滤液作为粗酶液。1 个酶活性单位定义为 30 μmol 没食子酸。0029x99980。棓单宁降解菌株的分离纯化根据初筛培养基的颜色变化和菌落形态，从火鸡单宁水提液中自然生长的菌落中分离纯化出11株。菌株播种和培养后，
从图中可以看出：细菌的降解率最低；然后虽然孵育时间继续增加，但3的降解率保持在一定值，100株的没食子单宁降解率达到45株的降解率。降解率为65的各菌株发酵液和标准品的薄层色谱图见图 ionbrot各菌株的色谱图 棓单宁的降解率 图 单宁酸降解 erentstr ains 。从图中可以看出，20株菌株在发酵开始时发酵培养基中没食子酸浓度缓慢升高，这可能是由于菌株刚刚连接到新培养基，处于调整期，它们的代谢系统需要适应新的环境，同时，合成酶、辅酶、其他中间代谢物等在20-60%以内，随着培养时间的增加，菌株开始迅速繁殖，细胞代谢产物快速积累，3株菌发酵培养基中没食子酸浓度近似线性增加。70年后，培养时间不断增加，3株没食子酸浓度变化不大，可能是由于培养后期细胞进入死亡阶段，分解代谢细胞大于合成代谢，导致大量细胞死亡。发酵后期没食子酸浓度的原因是没食子酸被细菌分泌的其他胞外酶降解。在发酵结束时(100)，酶生产活性被初步筛选。
从图中可以看出，20株的产酶活性随着50以内细胞的快速生长而增加，其中50株的单宁酶活性最高；则该菌株在 60 株发酵液中的没食子酸质量浓度如图所示。 没食子酸 erentstrains 菌株的单宁酶活性 图 erentstrains 活性综合图 细菌优化后期发酵条件，其没食子单宁降解率, 培养基中没食子酸浓度和产酶活性最高。与我国传统加压硫酸浸液水解没食子酸生产没食子酸工艺（单宁转化率70%以上）[22]，在本研究中，在不添加任何酸碱物质的情况下，细菌对没食子单宁的降解率高达65%，发酵液中没食子酸的质量浓度为L，具有单宁转化率高、绿色无污染的优点-自由的。优良没食子单宁降解菌发酵条件的优化选择初始pH为响应值，采用Design Expert响应的Box-Behnken方法建立回归模型及其显着性分析。表001表明，实验中使用的两个二级模型具有高度显着性和统计显着性。失配项05对模型有利，没有失配因素，所以回归方程可以代替实验实点来分析实验结果。在初级阶段，孵育温度（即初始pH值和孵育时间）的交互作用对鞣酸酶88酶活性有显着影响；在二次项中，孵育温度 ( , 初始 pH 值对单宁酶活性的影响非常显着。水平。
通过回归模型方差分析比较菌株的发酵条件，影响单宁酶活性的三个因素是培养温度的初始pH值、Box-Behnken设计方案和响应值。表 Box-Behnken 实验 设计 相应的提取离子 产生 初始 pH 初始 pH 孵育时间 UmL 测试编号 tannaaseactivi 1011 12 13 14 15 16 17 25 35 25 35 25 35 25 35 30 30 30 30 30 30 30 30 30 4848 48 48 36 3 60 60 48 36 3 48 48 48 回归模型的方差分析 方差分析 回归方程 表 方差 来源 变异 和平方 和平方 自由度 df 均方值 显着 显着 模型 模型 06623 6210 7837 7755 08974 拟合 纯误差 纯误差 有pH 值和孵育时间之间存在显着的交互作用，在等高线图中表现为椭圆。
交互作用项，即孵育温度和初始pH值、孵育温度和孵育时间，在形状上更接近圆形，表明交互作用不显着。最佳提取工艺参数的确定及验证实验 上述回归模型计算得到的菌株的最佳发酵条件为培养温度30.0℃。92. 初始 pH 值为 49.44 小时。在此条件下，模型预测的鞣酸酶活性最大值为mL。考虑到实验的可操作性[23]，将上述最佳参数分别调整为孵育温度31 ℃、初始pH 89、孵育时间50 h，并据此进行验证实验。平行测定 mL，与优化前最大酶活 mL 相比，增加了 27。 各因素对鞣酸酶活性相互作用的响应面图 图 11 从火鸡水提液中自然生长的菌落中分离纯化的 urfac anytwo 鞣酸酶活性菌株bazia 通过平板包被、条纹分离和菌落观察。具有高细胞外鞣酸酶活性。进一步通过测定发酵液中的酶活性、没食子单宁降解率和没食子酸浓度，重新筛选出细菌没食子单宁降解率高达65，发酵液中没食子酸的质量浓度肉汤是毫升。响应面法生产酶的最佳条件为培养温度为 31 ℃，初始pH为31，培养时间为50 h。最佳条件下，与1 mL相比，增加了27。五倍子化学成分研究[J]. Chinese Herbal Medicine, 2008, 39 C, ADIKARAMN, KU MARI HAMY M, et al. Rol antifungal gal lotannins, resorci nols chitinases constitutivedefence immaturemango Mangifera ndica against Col etotri chum gl oeospori oi des［J］．Journal Phytopathology, 2011, 159 [4] ENGELSC, WEISS A, CARLE R, et al. 影响单核细胞增生李斯特菌的附着、生长和存活[J]. 欧洲食品研究技术, 2012, 234 ERREZ-SANCHEZ Review: Sources, properties, applications potentialuses tanninacyl hydrolas FoodScience Technology International, 2011 Progress in没食子酸[J]. 食品工业科技，2013，34 电子级高纯没食子酸中试工艺研究［J］．现代化工，2009，29 没食子酸酶法转化没食子酸[J]. 精细化工, 2005, 13 高转化率生物工艺没食子酸研究［J］．林产化工学报, 1996, 30 单宁酶产酶菌的筛选及产酶条件[J]. 南京林业大学学报: 自然科学版, 2010, 34 [11] BELMARESR, CONT RE RAS-ESQUIVEL C, RODRGUEZ-HER RE RA, et al. 微生物生产必需食品工业［J］．食品科学技术, 2004, 37 857-864 D, MUGERAYA 微生物生产鞣酸酶：现状［J］. 研究期刊微生物学，2011 [13] 陶素芬，赵向英，刘建军。单宁酶产生菌株的筛选与选育［J］．食品科学，2012，33 ERREZ-SANCHEZ G 等人。微生物鞣酸酶：进展展望［J］．Applied Microbiol ogy Biotechnology, 2007, 76 C, FAVELA-TORRES repressionpatterns fungaltanase submergedcultures ProcessBio chemist ry, 2001, 36 [16] CHVEZ-GONZLEZM, RODR GUEZ-DUR USAMYN, et al, Overview of Biotechnol ogical Advances Challenges [J] . 食品生物工艺技术，2012 [17] JEAND，POU RAT H，POUR RAT A，等。鞣酸水解气相色谱法［J］．分析生物化学，1981，110 369-372 鞣酸酶活性测定方法的研究［J］．生物技术，2000，10 40-42 MARA，NAGPAL R，等．敏感板测定单宁酶产生菌［J］．Annals Microbiology, 2010, 60 [20] ****, Zhang Haisheng, Niu Guoxia, et al. 柿叶单宁提取工艺研究［J］．食品工业科技，2009 220-222 一种胞外鞣酸酶活性检测方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵腊. 从没食子中制备没食子酸的研究进展[J]. 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产化学与工业，2011，31综述［J］．食品生物工艺技术，2012 [17] JEAND，POU RAT H，POUR RAT A，等。鞣酸水解气相色谱法［J］．分析生物化学，1981，110 369-372 鞣酸酶活性测定方法的研究［J］．生物技术，2000，10 40-42 MARA，NAGPAL R，等．敏感板测定单宁酶产生菌［J］．Annals Microbiology, 2010, 60 [20] ****, Zhang Haisheng, Niu Guoxia, 等。柿叶单宁提取工艺研究［J］．食品工业科技, 2009 220-222 一种胞外单宁酶活性检测方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵腊.没食子制备没食子酸[J]. 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产化学与工业，2011，31综述［J］．食品生物工艺技术，2012 [17] JEAND，POU RAT H，POUR RAT A，等。鞣酸水解气相色谱法［J］．分析生物化学，1981，110 369-372 鞣酸酶活性测定方法的研究［J］．生物技术，2000，10 40-42 MARA，NAGPAL R，等．敏感板测定单宁酶产生菌［J］．Annals Microbiology, 2010, 60 [20] ****, Zhang Haisheng, Niu Guoxia, et al. 柿叶单宁提取工艺研究［J］．食品工业科技, 2009 220-222 一种胞外单宁酶活性检测方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵腊.没食子制备没食子酸[J]. 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产化学与工业, 2011, 31 220-222 一种检测细胞外鞣酸酶活性的方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵拉. 五倍子制备没食子酸的研究进展[J]. 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产化学与工业, 2011, 31 220-222 一种检测细胞外鞣酸酶活性的方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵拉. 没食子酸制备没食子酸的研究进展[J]. . 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产品化学与工业, 2011, 31 25 [23] 张良良，徐曼，王永梅，等．响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产化学与工业, 2011, 31 220-222 一种检测细胞外鞣酸酶活性的方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵拉. 没食子酸制备没食子酸的研究进展[J]. . 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产品化学与工业, 2011, 31 25 [23] 张良良，徐曼，王永梅，等．响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产化学与工业, 2011, 31 220-222 一种检测细胞外鞣酸酶活性的方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵拉. 没食子酸制备没食子酸的研究进展[J]. . 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产品化学与工业, 2011, 31 林产化学与工业, 2011, 31 220-222 一种检测细胞外鞣酸酶活性的方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵拉. 没食子酸制备没食子酸的研究进展[J]. . 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产品化学与工业, 2011, 31 林产化学与工业, 2011, 31 220-222 一种检测细胞外鞣酸酶活性的方法［J］．精细化工, 2008, 25 [22] 赵拉. 没食子酸制备没食子酸的研究进展[J]. . 化学与生物工程, 2008, 25 [23] 张良良,徐曼,王永梅,等。响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产品化学与工业, 2011, 31 响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产品化学与工业, 2011, 31 响应面法优化超声波提取香楸果实序列中鞣花酸[J]. 林产品化学与工业, 2011, 31
